В ХVI веке монастырь становится влиятельным экономическим и политическим центром. Сюда часто приезжал Иван IV Грозный. В музее находится его портрет, написанный в XVIII в. по летописному известию, содержащему описание внешности Иоанна Васильевича, государя-тирана, который имел «горбатый свислый нос, огненные карие очи и крутой нрав».



Второй зал экспозиции показывает развитие монастырского ансамбля в ХVI-XVII вв, процесс превращения его в мощную крепость, что прекрасно иллюстрируют макет монастыря и графические реконструкции. Одним из источников пополнения монастырской казны были вклады за право быть погребенными на его территории. В период Смутного времени здесь захоронили царя Бориса Годунова и членов его семьи. В результате археологических работ были обнаружены вещи, им принадлежавшие - кожаная туфелька царевны Ксении, крайне ветхий кружевной чепчик царицы Марии Федоровны, и главное, шелковая рубаха царевича Феодора. Демонстрация этих раритетов стала возможна благодаря виртуозной реставрации М.П.Рябовой.

О героизме защитников монастыря в период осады польско-литовских интервентов 1608-1610 гг. рассказывают разнообразные экспонаты: документы, портреты участников событий, произведения живописи и графики, реконструирующие различные эпизоды «троицкого сидения». В зале представлены интересные образцы оружия: холодное коляще-рубящее (бердыши, глефа или совня, палаш), ударное (кистени), оборонительное (кирасы, кольчуга, шлемы), подметные рогатки, больше известные как «троицкий чеснок». Благодаря стойкости своих защитников монастырь выдержал 16-месячную осаду, показав подлинный пример мужества для всего московского государства.

После осады в монастырь стали поступать значительные пожертвования, позволившие достаточно быстро восстановить и заново украсить обитель. Ее облик в середине XVII века запечатлен на редкой иконе этого времени. Она фиксирует не только архитектурные достоинства церквей и соборов, государевых палат и царицыных хором, келейных корпусов, крепостных сооружений, но и ледники, сады, колодцы, погреба, поваренную и оружейную палаты, что свидетельствует о хорошо организованной хозяйственной деятельности монастыря